引物设计原则和注意事项_引物设计原则
引物设计原则是：
1.引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp。
(资料图)
2.引物的GC含量一般为40%-60%，优选45%-55%，上下游引物的GC含量和Tm值要保持接近。
3.引物对应的模板序列的Tm值应该在72左右，至少在55-80之间，Tm曲线应该在72左右。5’到3’的下降形状也有利于引物和模板的结合。
4.G值(自由能)反映了引物和模板之间的结合强度。3’端的G值比较低，绝对值不能超过9，否则不利于反应的正确引发。当3’端双链的G值为0-2 kcal/mol时，PCR产率几乎为100%，但在-6时仅为40%，在-8时不到20%。-.
5.一般错配率不能超过100，否则会出现非预期的波段。然而，对于一些特定的模板序列，也应该比较正确位点的引发效率。如果两者相差较大，比如正确位点的引发效率在340以上，而错误位点的引发效率为110，并且很难找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的。
6.Frq曲线是Oligo6软件新引入的指标，解释序列片段的重复概率。选择引物时，应使用Frq值相对较低的片段。
7.引物二聚体和发夹结构能量的绝对值一般不应超过4.5，否则容易生成引物二聚体，降低引物浓度，导致PCR异常发生。
8、3’端不应是连续碱基，GGG或CCC会导致错误起始，3’端最后一个碱基不应是A或T，如果是，会导致错配。
9.用公式Tm=4*(G C) 2*(A T)-5计算Tm值，即退火温度。选择Tm值较低的引物的退火温度作为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，并在70-75范围内。
10.模板和稳定性较低的引物之间的Tm差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于其长度，如果预期产物长度等于或小于500bp，则选择末端引物(16-18bp)，如果产物长度为5kb，则使用24bp引物。
1.在DNA测序和PCR中，最好使用5’端稳定(GC含量高)、3’端不稳定(AT含量高)的引物。这种引物结构可以有效地消除假引发反应。
12.底漆和产品的Tm值相差太大，最佳范围是20。
13.通常，引物的修饰在5’端进行，例如，添加限制性位点，同时根据需要添加保护性碱基。
本文到此结束，希望对大家有所帮助。
